Tipos de microscopios de fluorescencia

Cuando los microscopios fueron inventados alrededor de 1600 C. E., filósofos naturales volvieron sus ojos a un mundo dentro de otro mundo. Cuando Antony van Leeuwenhoek hace a mano lentes pequeñas, altamente curvadas y un soporte mecánico para el ajuste del punto de vista, se abrió una ventana al mundo microscópico de bacterias, células de la sangre, protozoos y la estructura celular de las plantas. Pero a lo largo de la historia de la microscopía, siempre ha habido una pregunta: ¿Cuáles son esas cosas extrañas visto a través de una lente? La microscopia de fluorescencia se refiere a un conjunto de técnicas que minimiza la incertidumbre que - debido a que en la microscopía de fluorescencia cuando la luz se brilla en una muestra, que brilla con luz propia la derecha de nuevo.

epifluorescencia

Con mucho, el microscopio de fluorescencia más común es la configuración de epifluorescencia. En un microscopio de epifluorescencia, una fuente de luz - típicamente una lámpara de mercurio o xenón - brilla a través de un filtro que selecciona una región estrecha de longitudes de onda. La luz filtrada brilla sobre la muestra a través de la lente del objetivo del microscopio. La luz entrante es absorbida por fluoróforos - etiquetas moleculares que emiten luz de una longitud de onda larga cuando absorben luz de una longitud de onda más corta. La luz procedente de los fluoróforos, junto con la luz dispersada desde la fuente de iluminación, vuelve a entrar en la lente objetivo y al detector o los ojos. En el camino, otros bloques de filtrar la luz de iluminación, por lo que todo lo que queda es la luz fluorescente de la muestra.

confocal

Un microscopio de epifluorescencia recoge la luz desde cualquier lugar dentro del campo de visión del microscopio. Parte de la luz de excitación es absorbida antes de que el plano focal del microscopio, algunos en el plano focal y un poco más allá del plano focal. Debido a que el microscopio recoge toda esa luz, la imagen contendrá una imagen nítida de la luz en el foco, sino que también tendrá la luz fuera de foco de otras regiones. Un microscopio confocal fija que enfocando un punto láser en el mismo plano que el microscopio está enfocado. A continuación, un agujero pasa delante del detector, donde bloquea toda la luz que no viene desde el foco del microscopio. Mediante la exploración de la muestra, una imagen tridimensional limpio del objeto se puede obtener.

multifotónica

En un microscopio confocal de la alineación es muy sensible. Si el punto láser, el objetivo del microscopio, la óptica de recogida y la estenopeica están fuera de la más mínima cantidad que el rendimiento sufre microscopio. Un microscopio multifotónica evita este problema mediante el uso de una longitud de onda láser que es sólo la mitad de energía, ya que tiene que ser para excitar los fluoróforos en la muestra. La única forma en que los fluoróforos se van a entusiasmar y emiten fluorescencia es si la luz láser es suficientemente brillante como para que dos partículas de luz - fotones - Huelga el fluoróforo en un tiempo muy corto. Eso sólo ocurre cuando el láser se enfoca a un lugar muy pequeño. Por lo que el único lugar en la muestra que se emita luz es donde el láser se enfoca, lo que mantiene la imagen agradable y limpio porque no hay luz de fondo extra para deshacerse de - lo que significa que no hay agujero de alfiler para alinear.

Fluorescencia de reflexión total interna (TIRF)

Otra forma de obtener imágenes muy limpias es asegurarse de que la luz de excitación no llega muy lejos en la muestra. Si una gota de neuronas, por ejemplo, se coloca en una gota de solución en un portaobjetos de vidrio, a continuación, algunas de las neuronas se adherirá a la superficie del vidrio. En un microscopio de fluorescencia de reflexión total interna (TIRF) la luz se dirige hacia los lados en el portaobjetos de vidrio de modo que en realidad no lo hacen en la solución que sostiene las células. Pero algo de la luz apenas se filtra en la solución - sólo muy cerca de la superficie del vidrio. Esto significa que los únicos lugares que emiten luz estará en una región muy delgada justo contra la superficie del vidrio. Para algo así como las neuronas, donde hay tanto material interesante ocurre en la superficie de las células, esta técnica puede ser muy eficaz.

Súper resolución

Todos los microscopios - incluyendo microscopios de fluorescencia - están limitados por la física que gobierna la propagación de la luz. Una de las reglas básicas es que un punto de luz enfocado solamente puede ser tan pequeña - y no más pequeño. Para la luz visible, que el tamaño es de aproximadamente 200 nanómetros, o 200 mil millonésima parte de un metro. Pero las moléculas individuales son sólo unos pocos nanómetros de tamaño, por lo que hay un montón de características interesantes que están por debajo de ese límite de tamaño, llamados el límite de difracción. Los científicos están desarrollando "súper resolución" técnicas para colarse alrededor de ese límite. microscopía estructurado de iluminación (SIM) y microscopía estimulada agotamiento de emisión (STED), por ejemplo, son los dos métodos de microscopía de fluorescencia que limitan el tamaño del punto de emisión de luz por la reducción del tamaño del punto de luz de excitación.

referencias

• enlazar MicroscopeHelp.com: La historia del microscopio
• enlazar Universidad del Estado de Florida: técnicas especializadas Microscopía --- microscopía de fluorescencia
• enlazar Applied Precision: Super-Resolución de la tecnología

Sobre el Autor

Publicado por primera vez en 1998, Richard Gaughan ha contribuido a publicaciones como "Fotónica Spectra," "El Científico" y otras revistas. Él es el autor de "Genius accidental: El más grande de Al-descubrimientos fortuitos Mundial." Gaughan tiene una licenciatura en Ciencias en Física por la Universidad de Chicago.